菌種的保存
發(fā)布日期：2017-12-26 瀏覽次數(shù)：3158
1 斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8℃的冰箱中保藏。
保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌保存 2—4 個月，移種一次。酵母菌兩個月，細(xì)菌每月移種一次。
2 液體石蠟保藏法
- 將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘，然后放在 40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。
- 將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。
- 用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端 1cm 為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。
- 將試管直立，置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長)。
3 濾紙保藏法
- 將濾紙剪成 0.5×1.2cm 的小條，裝入 0.6×8cm 的安瓿管中，每管 1—2 張，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘。
- 將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使充分生長。
- 取滅菌脫脂牛乳 1—2ml 滴加在滅菌培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，取數(shù)環(huán)菌苔在牛乳內(nèi)混勻，制成濃懸液。
- 用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內(nèi)，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
- 將安瓿管放入內(nèi)有五氧化二磷作吸水劑的干燥器中，用真空泵抽氣至干。
- 將棉花塞入管內(nèi)，用火焰按圖Ⅶ-13 熔封，保存于低溫下。
- 需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟后，取出濾紙，放入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
4 沙土保藏法
- 取河沙加入 10%稀鹽酸，加熱煮沸 30 分鐘，以去除其中的有機質(zhì)。
- 倒去酸水，用自來水沖洗至中性。
- 烘干，用 40 目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。
- 另取非耕作層的不含腐植質(zhì)的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。
- 烘干，碾碎，通過 100 目篩子過篩，以去除粗顆粒。
- 按一份黃土、三份沙的比例(或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻，裝入 10×100mm 的小試管或安瓿管中，每管裝 1g 左右，塞上棉塞，進(jìn)行滅菌，烘干。
- 抽樣進(jìn)行無菌檢查，每 10 支沙土管抽一支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng) 48 小時，若仍有雜菌，則需全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。
- 選擇培養(yǎng)成熟的(一般指孢子層生長豐滿的，營養(yǎng)細(xì)胞用此法效果不好)優(yōu)良菌種，以無菌水洗下，制成孢子懸液。
- 于每支沙土管中加入約 0.5ml(一般以剛剛使沙土潤濕為宜)孢子懸液，以接種針拌勻。
- 放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵抽干水分，抽干時間越短越好，務(wù)使在 12 小時內(nèi)抽干。
- 每 10 支抽取一支，用接種環(huán)取出少數(shù)沙粒，接種于斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察生長情況和有無雜菌生長，如出現(xiàn)雜菌或菌落數(shù)很少或根本不長，則說明制作的沙土管有問題，尚須進(jìn)一步抽樣檢查。
- 若經(jīng)檢查沒有問題，用火焰熔封管口，放冰箱或室內(nèi)干燥處保存。每半年檢查一次活力和雜菌情況。
- 需要使用菌種，復(fù)活培養(yǎng)時，取沙土少許移入液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱中培養(yǎng)。
5 液氮冷凍保藏法
- 準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用 75×10mm 的，或能容 1.2mm 液體的。
- 加保護劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌 15 分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護劑如 10%的甘油蒸餾水溶液或 10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 15 分鐘。
- 接入菌種將菌種用 10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
- 凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降 1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。
- 保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
- 恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
?6 冷凍干燥保藏法
- 準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15)，大小要求外徑 6—7.5mm，長 105mm，球部直徑 9—11mm，壁厚 0.6—1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌 30 分鐘，備用。
- 準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在zui適培養(yǎng)基中用zui適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求 24—48 小時的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng) 3 天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養(yǎng) 7—10 天。
- 制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳 2ml 左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝 0.2ml。
- 冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體 CO2>)酒精液或干冰丙酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍 4—5 分鐘，即可使懸液結(jié)冰。
- 真空干燥為在真空干燥時使樣品保持凍結(jié)狀態(tài)，需準(zhǔn)備冷凍槽，槽內(nèi)放碎冰塊與食鹽，混合均勻，可冷至-15℃。裝置儀器如圖Ⅶ-16，安瓿管放入冷凍槽中的干燥瓶內(nèi)。抽氣一般若在 30 分鐘內(nèi)能達(dá)到 93.3Pa(0.7mmHg)真空度時，則干燥物不致熔化，以后再繼續(xù)抽氣，幾小時內(nèi)，肉眼可觀察到被干燥物已趨干燥，一般抽到真空度 26.7Pa(0.2mmHg)，保持壓力6—8 小時即可。封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用 L 形五通管(圖Ⅶ-17)繼續(xù)抽氣，約 10 分鐘即可達(dá)到 26.7Pa(0.2mmHg)。于真空狀態(tài)下，以煤氣噴燈的細(xì)火焰在安瓿管頸中央進(jìn)行封口。封口以后，保存于冰箱或室溫暗處。
