電話(huà)：
021-67610176傳真：
蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價(jià)修飾方式之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮及腫瘤發(fā)生等過(guò)程在內(nèi)的所有生命活動(dòng)。目前已知有許多人類(lèi)疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導(dǎo)致的后果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過(guò)磷酸化修飾；在脊椎動(dòng)物基因組中，有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過(guò)程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修飾本身所具有的簡(jiǎn)單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團(tuán)的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細(xì)胞所選擇接受而成為一種zui普遍的調(diào)控手段。鑒于磷酸化修飾在生命活動(dòng)中所具有的重要意義，探索磷酸化修飾過(guò)程的奧秘及其對(duì)細(xì)胞功能的影響已成為眾多生物化學(xué)家及蛋白組學(xué)家所關(guān)心的內(nèi)容。用蛋白質(zhì)組學(xué)的理念和分析方法研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾，可以從整體上觀(guān)察細(xì)胞或組織中磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化，這對(duì)以某一種或幾種激酶及其產(chǎn)物為研究對(duì)象的經(jīng)典分析方法是一個(gè)重要的補(bǔ)充，同時(shí)提供了一個(gè)全新的研究視角，并由此派生出磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（phosphoproteomics）這一新概念。在蛋白質(zhì)組學(xué)水平進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)的分析定量研究已引起人們廣泛關(guān)注，各種技術(shù)也相應(yīng)地發(fā)展起來(lái)。
1. 磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸肽的富集
1.1 免疫親和色譜
富集磷酸化蛋白質(zhì)zui簡(jiǎn)單的方法就是用識(shí)別磷酸化氨基酸殘基的特異抗體進(jìn)行免疫共沉淀，從復(fù)雜混合物中免疫沉淀出目標(biāo)蛋白質(zhì)。目前，僅有酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的單克隆抗體可以用來(lái)進(jìn)行有效的免疫共沉淀。這是因?yàn)樵摽贵w具有較強(qiáng)的親和力和特異性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。Imam-Sghiouar等人從B-淋巴細(xì)胞中通過(guò)免疫沉淀獲得酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)，然后再用二維電泳分離技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜分析方法，鑒定出多個(gè)與斯科特綜合癥相關(guān)的酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)。由于抗磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的抗原決定簇較小，所以令抗原抗體的結(jié)合位點(diǎn)存在空間障礙，特異性較差。因此，目前采用磷酸化絲氨酸/蘇氨酸的抗體來(lái)富集磷酸化蛋白質(zhì)的研究相對(duì)較 少。
1.2 固相金屬親和色譜（IMAC）
固相金屬親和色譜（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一項(xiàng)較為成熟的磷酸化多肽分離富集技術(shù)。它是利用磷酸基團(tuán)與固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金屬離子的高親和力來(lái)富集磷酸肽。目前發(fā)展的高通量磷酸化蛋白質(zhì)組分析途徑主要采用IMAC親和色譜-反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜-數(shù)據(jù)庫(kù)檢索聯(lián)用的方法。Ficarro等人zui先將IMAC富集技術(shù)應(yīng)用到細(xì)胞系大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的分析中，并從啤酒酵母中鑒定出了216個(gè)磷酸化肽段和383個(gè)磷酸化位點(diǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)每個(gè)可溶磷酸肽，不管其長(zhǎng)度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脫下的樣品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丟失一些與IMAC柱結(jié)合能力較弱的磷酸肽或某些因有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)而難以洗脫的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段與固相金屬離子也有結(jié)合能力，也可能被富集。為了解決IMAC柱的非特異性吸附的問(wèn)題，可以采用對(duì)羧基進(jìn)行酯化反應(yīng)以及改變洗脫液的體系等方法來(lái)提高IMAC柱的特異性。此外，自動(dòng)化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技術(shù)平臺(tái)的研究開(kāi)發(fā)，使磷酸肽的富集、反相分離和質(zhì)譜檢測(cè)都能自動(dòng)在線(xiàn)進(jìn)行，為IMAC在蛋白質(zhì)組學(xué)中的高通量應(yīng)用開(kāi)辟了道路。
1.3 TiO2色譜
近期金屬氧化物親和富集技術(shù)得到了人們極大的關(guān)注。2004年，Pinkse等人將二氧化鈦（TiO2）技術(shù)引進(jìn)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，利用TiO2與磷酸肽上磷酸基團(tuán)的親和能力實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸肽的相對(duì)富集，并建立了通過(guò)TiO2作為預(yù)分離的2D-NanoLCESI-MS/MS 技術(shù)平臺(tái)。雖然該技術(shù)在對(duì)磷酸化肽段富集時(shí)的選擇性和靈敏度方面都優(yōu)于IMAC技術(shù)，但仍然存在非特異性吸附等問(wèn)題。后來(lái)，人們又利用納米材料比表面積大的特點(diǎn)，對(duì)TiO2納米級(jí)材料進(jìn)行了開(kāi)發(fā)研究，從而進(jìn)一步增強(qiáng)了該技術(shù)對(duì)磷酸化肽段富集的巨大潛力。但是，目前納米級(jí)的TiO2富集磷酸化肽段技術(shù)還只能適于MALDI源的質(zhì)譜儀，在ESI源質(zhì)譜儀中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。
1.4 離子交換色譜
離子交換色譜是利用物質(zhì)的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑的相互作用不同來(lái)達(dá)到分離純化的目的。Beausoleil等人發(fā)現(xiàn)大部分磷酸化肽在pH 2.7的溶液中所帶凈電荷是1+，而非磷酸化肽所帶凈電荷大部分為2+，因此，利用強(qiáng)陽(yáng)離子交換（strong cattion exchange, SCE）技術(shù)就可以將磷酸化肽與非磷酸化肽分離開(kāi)來(lái)。磷酸化肽zui先被洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)相對(duì)富集。有人曾利用這一方法分離出了人HeLa細(xì)胞核蛋白的磷酸化肽。但該法也有不足之處，因?yàn)橛幸恍┝姿峄乃鶐щ姾梢彩?+，甚至帶有更多的電荷，這種情況下就會(huì)造成部分磷酸化肽的丟失。
1.5 親/疏水作用色譜
磷酸肽按照其疏水性不同而采用RP-HPLC進(jìn)行分離。RP-HPLC分離是減少混合肽中的復(fù)雜成分的一個(gè)十分重要的方法。該方法重現(xiàn)性好、簡(jiǎn)單且不需要特別的設(shè)備。極少量的磷酸化肽也可以在低流速下用毛細(xì)管柱分離。需要注意的是，高親水性的磷酸肽可能并未被吸附在柱上而直接流過(guò)色譜柱，而高疏水性的肽則會(huì)到zui高梯度時(shí)才會(huì)被洗脫甚至可能不被洗脫，因此在樣本中有些磷酸多肽無(wú)法被檢測(cè)到。再者，磷酸多肽吸附于金屬表面上，如果使用金屬注射器則可能發(fā)生顯著的樣品丟失。盡管如此，RP-HPLC仍在磷酸多肽分析中得到廣泛的應(yīng)用，這是因?yàn)樗菀着c質(zhì)譜聯(lián)用，并且即使分析物沒(méi)有同位素標(biāo)記，也可以在樣本混合物中發(fā)現(xiàn)和描述磷酸化肽。
1.6 磷酸基團(tuán)的化學(xué)修飾
近來(lái)，有人將肽或蛋白混合物置于堿性硫代二乙醇溶液中，通過(guò)β消除從磷酸化絲氨酸或蘇氨酸中去掉磷酸基團(tuán)H3PO4，形成的雙鍵受到硫代二乙醇的作用，巰基取代磷酸基團(tuán)，生物素與巰基相連，被標(biāo)記的肽或蛋白質(zhì)上樣于固定有親和素的層析柱，通過(guò)生物素與親和素的高親和力作用而達(dá)到磷酸化肽或蛋白質(zhì)富集的目的。這一方法的主要缺點(diǎn)在于它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)和肽。Zhou等人用另外一種方法修飾磷酸化肽，用碳二亞胺濃縮反應(yīng)將半胱氨酸加在磷酸基團(tuán)部分，修飾過(guò)的肽段以共價(jià)鍵與碘乙酰胺樹(shù)脂結(jié)合，酸洗滌釋放。此方法既可用于富集磷酸化酪氨酸，可用于富集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要多步化學(xué)反應(yīng)和柱純化過(guò)程?；瘜W(xué)修飾方法zui大的缺點(diǎn)在于整個(gè)過(guò)程需要大量蛋白，不利于低豐度蛋白的檢測(cè)。
2. 生物質(zhì)譜分析磷酸化位點(diǎn)
用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜依電離源的不同分為兩種：基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（electrosp ray ionization mass spectrometry, ESI-MS）。前者利用基質(zhì)吸收激光的能量使固相的多肽樣品離子化，后者則在噴射過(guò)程中利用電場(chǎng)使液相的多肽樣品離子化。離子化的肽段進(jìn)入質(zhì)量分析器，因質(zhì)量電荷比（m/z）差異發(fā)生分離，通過(guò)測(cè)量肽段離子的相關(guān)參數(shù)，可獲得肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprint, PMF）、肽序列標(biāo)簽（peptide sequence tag, PST）或部分氨基酸序列。zui后，應(yīng)用適當(dāng)?shù)能浖褜せ蚪M和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定性鑒定及功能分析。
2.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）
MALDI-TOF-MS由于操作簡(jiǎn)單、敏感性強(qiáng)、價(jià)格低廉而廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)鑒定工作。不過(guò)，將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)磷酸化研究就遇到了問(wèn)題。磷酸化肽段帶負(fù)電荷，而生物質(zhì)譜常用正離子模式，導(dǎo)致離子化程度低；大量非磷酸化肽段的信號(hào)抑制了磷酸化肽段的信號(hào)并且在肽質(zhì)量指紋圖中缺少標(biāo)志性離子。因而，MALDI-TOF-MS通過(guò)與堿性磷酸酶的去磷酸化作用或與氫氟酸相結(jié)合來(lái)鑒定磷酸化肽段。絲氨酸和蘇氨酸磷酸化肽段會(huì)丟失磷酸基團(tuán)（-98 u），而酪氨酸磷酸化肽段會(huì)去磷酸化（-80 u）。MALDI-TOF的另一特征可以進(jìn)行亞穩(wěn)態(tài)裂解分析，即源后衰變（post source decay, PSD）。前離子從離子源內(nèi)解析電離過(guò)程中獲得的內(nèi)能在無(wú)場(chǎng)漂移區(qū)內(nèi)飛行過(guò)程中通過(guò)發(fā)生斷裂而釋放其能量，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為源后衰變。由此得到的碎片離子與前離子有相同的飛行速度但能量不同，在反射器內(nèi)穿越的深度不一，可被反射器按其質(zhì)量大?。茨芰看笮。男〉酱笠来畏瓷洌⒌竭_(dá)檢測(cè)器檢測(cè)。
2.2 串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）
生物質(zhì)譜的質(zhì)量分析器有不同的選擇，如三級(jí)四級(jí)桿、離子阱、飛行時(shí)間、傅立葉回旋共振等質(zhì)量分析器。將兩個(gè)質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器串聯(lián)，*個(gè)質(zhì)量分析器將預(yù)測(cè)組分與其它組分分離，第二個(gè)質(zhì)量分析器對(duì)其進(jìn)行掃描，產(chǎn)生該組分的質(zhì)譜圖即為串連質(zhì)譜。利用三級(jí)四級(jí)桿、四級(jí)桿-飛行時(shí)間、四級(jí)桿-離子阱進(jìn)行前體離子掃描或中性丟失掃描，可鑒定磷酸化位點(diǎn)。
前體離子掃描是利用絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化肽段在碰撞誘導(dǎo)解離（CID）時(shí)會(huì)發(fā)生磷酸基團(tuán)丟失的原理來(lái)實(shí)施檢測(cè)的。這些丟失的磷酸基團(tuán)可以作為磷酸肽的“報(bào)告離子”：在陰離子模式下，*個(gè)四級(jí)桿用來(lái)進(jìn)行全譜掃描，CID在第二個(gè)四級(jí)桿中進(jìn)行，第三個(gè)四級(jí)桿只選擇通過(guò)質(zhì)荷比為79的離子（即PO3-，m/z 79），用來(lái)鑒定磷酸化肽段。一旦磷酸化肽段被鑒定出來(lái)后，質(zhì)譜便轉(zhuǎn)為陽(yáng)離子掃描模式，進(jìn)行肽段的測(cè)序。前體離子掃描的另一種方式是直接進(jìn)行陽(yáng)離子掃描，immonium離子（m/z 216.04）是酪氨酸磷酸化肽段的特征性碎片離子。而絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段涉及到對(duì)殘基上的磷酸基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾。在脫磷酸基團(tuán)和發(fā)生β消除反應(yīng)后，加入合成的巰基季銨進(jìn)行加成反應(yīng)，然后在低能量的CID下，產(chǎn)生特異的小分子碎片（m/z 122.06）。
中性丟失掃描在質(zhì)譜檢測(cè)磷酸化位點(diǎn)中也有重要地位。在陽(yáng)離子掃描模式下，絲氨酸、蘇氨酸磷酸化肽段會(huì)失去H3PO4或HPO3，從而質(zhì)量數(shù)會(huì)減少98u或80 u。中性丟失掃描的優(yōu)點(diǎn)是*可以在陽(yáng)離子模式下操作，而不像前體離子掃描那樣要變換離子掃描方式，并且此方法在離子阱分析器中也有很好的利用。因?yàn)橘|(zhì)譜檢測(cè)到的是質(zhì)量電荷比而不是質(zhì)量本身，所以中性丟失掃描時(shí)檢測(cè)到的信號(hào)可能有幾個(gè)數(shù)值。例如，在失去H3PO4的情況下，若離子帶單電荷，則檢測(cè)到98 u，若帶雙電荷或三電荷，則會(huì)相應(yīng)檢測(cè)到49.0 u和32.7 u；在CID時(shí)發(fā)生β消除反應(yīng)時(shí)，失去的有可能是H3PO4（98 u）也有可能是HPO3（80 u），從而使分析復(fù)雜化。
2.3 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR MS）
傅里葉離子回旋共振（Fourier transform ion cyclotron resonance, FT-ICR）質(zhì)譜儀是一種相對(duì)較新的質(zhì)譜儀，具有相當(dāng)高的分辨率和準(zhǔn)確性，是幾乎現(xiàn)有的生物質(zhì)譜儀中功能zui強(qiáng)大的一種。FT-ICR的碎片模式是電子俘獲分裂，其原理是照射一束亞熱態(tài)的電子到電噴霧所產(chǎn)生的磷酸化肽段或者小分子蛋白本身，使其形成碎片。zui重要的是磷酸基團(tuán)在電子俘獲分析（electron cap ture dissociation, ECD）中被保留在碎片分子中，使得直接判斷磷酸化位點(diǎn)成為可能。FT-ICR的分辨率*，是其它生物質(zhì)譜的10倍。因而，對(duì)于小分子蛋白可以不用酶解而可以直接分析其磷酸化狀態(tài)。這項(xiàng)技術(shù)zui大的缺點(diǎn)在于，必須是較純的樣品才能進(jìn)行ECD分析，而且儀器的價(jià)格較為昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也較高。
2.4 液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）
色譜的優(yōu)勢(shì)在于分離，為混合物的分離提供了zui有效的選擇，但其難以得到物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，主要依靠與標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)比來(lái)判斷未知物，對(duì)無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)還要通過(guò)其它途徑進(jìn)行分析。質(zhì)譜能夠提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，用樣量也非常少，但其分析的樣品需要進(jìn)行純化，具有一定的純度之后才可以直接進(jìn)行分析。因此，人們期望將色譜與質(zhì)譜聯(lián)合使用以彌補(bǔ)這兩種儀器各自的缺點(diǎn)。采用LC-MS結(jié)合SEQUEST運(yùn)算法則，就可以進(jìn)一步降低樣品的復(fù)雜性，從而能夠?qū)Φ拓S度磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
3. 定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)
3.1 雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析仍然是分離和鑒定蛋白質(zhì)的主要手段。二維電泳（2-DE）根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、可溶性及相對(duì)豐度來(lái)分離蛋白。2-DE結(jié)合敏感銀染方法已成功分離和鑒定了TGF-β和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的大量分子。該方法首先使用泛抗磷酸化絲/蘇氨酸抗體或（和）泛抗磷酸化酪氨酸抗體，富集細(xì)胞被刺激前后的絲/蘇氨酸或（和）酪氨酸磷酸化蛋白分子，進(jìn)行2-DE分離；然后比較刺激前后的圖譜以獲取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；隨后再用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定，zui終獲得刺激因子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)分子的磷酸化改變，即信號(hào)分子是否活化。
在上述基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的更加敏感且能進(jìn)行定量分析凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)的新方法叫做熒光差異雙向凝膠電泳（fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D DIGE）。它采用熒光試劑來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)并通過(guò)熒光成像來(lái)獲取電泳圖像。其優(yōu)點(diǎn)是可以在同一塊凝膠上比較兩種處理不同或來(lái)源不同的蛋白質(zhì)組表達(dá)，能夠比較地在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)使對(duì)研究者感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，特別對(duì)包括有多組別和多個(gè)生物學(xué)重復(fù)情況的研究具有其*的優(yōu)勢(shì)。
3.2 熒光染料Pro-Q Diamond dye染色
32P放射性標(biāo)記（32P-labeling）可以非常靈敏、直觀(guān)地檢測(cè)磷酸化蛋白。早在1991年，該技術(shù)便在研究磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析中表現(xiàn)出了一定的應(yīng)用前景。但32P高放射性對(duì)細(xì)胞造成損害并對(duì)磷酸化狀態(tài)有影響，此外還存在不能標(biāo)記組織樣本，有放射性污染等問(wèn)題。熒光染料染色（Pro-Q Diamond）是MolecularProbes公司前幾年推出的一種磷酸化蛋白質(zhì)的熒光染料，它可以直接對(duì)聚丙烯酰胺凝膠中的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性染色，無(wú)需同位素或特異性抗體，只有通過(guò)熒光掃描儀檢測(cè)就可以直接顯示出一維或二維凝膠電泳膠上分離的磷酸化蛋白質(zhì)，對(duì)非磷酸化蛋白質(zhì)的反應(yīng)性很低，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著蛋白質(zhì)磷酸化程度的不同而呈現(xiàn)出一定的變化。這種染料與質(zhì)譜兼容，膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)可以通過(guò)膠上酶切進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。Chen等人將32P放射性標(biāo)記和Pro-Q染色兩種方法結(jié)合起來(lái)分析中國(guó)鼠卵巢細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在定量磷酸化蛋白質(zhì)時(shí)，結(jié)果受標(biāo)記時(shí)間的影響，而且放射性標(biāo)記的磷酸化蛋白質(zhì)與Pro-Q磷酸化染料所染出的磷酸化蛋白質(zhì)之間相關(guān)性較差。Hopper等人分別用2DE-Pro-QDiamond染料方法和32P放射性標(biāo)記方法分析了豬心線(xiàn)粒體中的磷酸化蛋白質(zhì)組，也同樣發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)性較差的問(wèn)題。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，32P標(biāo)記比Pro-Q Diamond方法更靈敏，特別是能更好地檢測(cè)那些磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率高的蛋白質(zhì)。但是，Pro-Q Diamond對(duì)豐度較高但磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化速率較低的蛋白質(zhì)具有更高的靈敏度。然而對(duì)于不同的磷酸化位點(diǎn)，Pro-Q Diamond的靈敏度也并非一成不變。
3.3 穩(wěn)定同位素標(biāo)記
2000年，Weckwerth、Willmitzer和Fiehn等人提出穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable-isotope labeling, SIL）與LC/MS結(jié)合使用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，從而開(kāi)辟了定量蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)新技術(shù)平臺(tái)。與傳統(tǒng)的定量方法（如2-DE）相比，穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)在定量準(zhǔn)確度和規(guī)模化定量分析方面都有很大的應(yīng)用前景。在磷酸化蛋白質(zhì)差異定量研究中，目前常用以下幾種穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量方法。
3.3.1 18O標(biāo)記技術(shù)
18O標(biāo)記技術(shù)是將蛋白質(zhì)酶切時(shí)或酶切后放入H218O中，在蛋白酶催化作用下將羧基上的兩個(gè)氧替換成18O而進(jìn)行的。除了C端肽之外，在適宜的條件下，所有的肽段一般都可以替換上兩個(gè)18O，使肽段質(zhì)量數(shù)相差4 u。Korbel等人[29]采取免疫沉淀反應(yīng)/IDE/LC/MS與18O標(biāo)記來(lái)分析EPO受體依賴(lài)的蛋白質(zhì)，鑒定并定量了187個(gè)磷酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)89個(gè)蛋白質(zhì)上的酪氨酸以EPO受體依賴(lài)的方式發(fā)生變化。18O標(biāo)記技術(shù)是一種操作簡(jiǎn)單、條件溫和、應(yīng)用廣泛（trypsin、chymotrypsin、lys-C和glu-C都能被用來(lái)標(biāo)記酶切肽段的C端），并且沒(méi)有副產(chǎn)物的標(biāo)記技術(shù)。它能與多種磷酸化肽段富集方法連用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標(biāo)記。目前，18O標(biāo)記技術(shù)已得到上一些大型實(shí)驗(yàn)室的青睞。但是，用18O進(jìn)行同位素標(biāo)記經(jīng)常產(chǎn)生標(biāo)記一個(gè)氧原子和兩個(gè)氧原子不等的現(xiàn)象，即產(chǎn)生分子質(zhì)量+2和+4兩種混合的產(chǎn)物。此外，18O與16O 交換速率也依肽段的大小、氨基酸的類(lèi)型、酶的類(lèi)型以及肽段序列而有所變化。所以，盡管該技術(shù)已經(jīng)得到比較普遍的應(yīng)用，但是要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果還需對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化。
3.3.2 同位素代謝標(biāo)記技術(shù)
15N標(biāo)記法（15N labeling）是Oda等人zui早提出的一種同位素代謝標(biāo)記技術(shù)，它是在培養(yǎng)基中分別摻入14N和15N來(lái)尋找差異表達(dá)蛋白的一種方法。雖然該方法非常適用于追蹤單個(gè)磷酸化位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)變化，但它于分析那些表達(dá)水平相對(duì)較高的蛋白質(zhì)。
SILAC（stable isotope labeling by amino acid in cellculture）技術(shù)[25]出現(xiàn)以后，很快取代了15N標(biāo)記法。SILAC技術(shù)，即細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)（表2），因而迅速獲得認(rèn)可并在實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用。已經(jīng)使用過(guò)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸有精氨酸（Arg）、賴(lài)氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和亮氨酸（Leu）等。
3.3.3 化學(xué)標(biāo)記技術(shù)
目前，化學(xué)標(biāo)記技術(shù)發(fā)展的基本化學(xué)原理主要有針對(duì)肽段上磷酸基團(tuán)的β消除-馬氏加成反應(yīng)和在羧基端的酯化反應(yīng)以及氨基端的酰化反應(yīng)。其中，β消除-馬氏加成反應(yīng)用得，其基本原理是使磷酸化肽段的磷酸基團(tuán)在堿性環(huán)境下發(fā)生β消除形成雙鍵，同時(shí)用標(biāo)有不同同位素的親核試劑與雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)以取代磷酸基團(tuán)。該技術(shù)是專(zhuān)門(mén)針對(duì)磷酸化肽段而建立的，但較多的化學(xué)修飾以及純化步驟，造成了大量樣本的損失，而且在沒(méi)有預(yù)分離和處理的情況下，該反應(yīng)對(duì)O-糖基化肽段也起反應(yīng)，所以在結(jié)果中將導(dǎo)致兩種類(lèi)型肽段的混淆。Thompson等人將IMAC技術(shù)與β消除-馬氏加成反應(yīng)結(jié)合來(lái)分析定量磷酸化蛋白質(zhì)。他們首先用IMAC親和富集磷酸化肽段，然后用堿性溶液令磷酸化肽段發(fā)生β消除，與此同時(shí)磷酸化肽段也被洗脫下來(lái)，接著進(jìn)行馬氏加成反應(yīng)從而標(biāo)記上含有不同同位素的標(biāo)簽。 各種各樣的化學(xué)修飾技術(shù)為磷酸化蛋白質(zhì)的定量帶來(lái)了可喜的前景，但這些化學(xué)修飾方法本身固有的反應(yīng)效率、副產(chǎn)物等問(wèn)題以及在大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)定量研究中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。
13916499749
