| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
溴化乙錠
Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)
Tween20，10% 溶液
2. 酶和酶緩沖液
dNTP 溶液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 25 mmol/L)
PCR 緩沖液，10X, 用戶買熱穩(wěn)定聚合酶時公司一并提供，或者 PCR 優(yōu)化緩沖液，比如，Opti-Prime PCR 優(yōu)化試劑盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)
熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)
3. 核酸和寡核苷酸
可選擇：插入物特異的引物（在雙向克隆中用來確定插入物的方向）
一套篩選重組體的引物
4. 設(shè)備
用于劃板和接菌的無菌槍頭
用槍頭代替牙簽，是因為牙簽可通過毛細(xì)作用帶走液體，因此會改變反應(yīng)混合物的濃度。
5. 額外項目
瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備和試劑，包括溴化乙錠
二、方法
1. 根據(jù)反應(yīng)數(shù)目或要做的 PCR 反應(yīng)的管數(shù)，在冰上用一個離心管像調(diào)雞尾酒一樣準(zhǔn)備
PCR「雞尾酒」式混合物，按如下順序依次加入各種成分。
H2O 將終體積補充到 25ul
Taq 緩沖液，10X 2.5ul
Tween20(體積分?jǐn)?shù) 10% 溶液） 1.0ul
dNTP 混合物（每種 dNTP 為 25 mmol/L) 0.2ul
重組體篩選引物套（100ng/ul) 1ul
Taq 延伸 PCR 添加劑（5U/ul) 0.25ul
Taq DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul
2. 在冰上，分裝"雞尾酒"式 PCR 混合物到每一個 PCR 試管中，每管移取 25ul。
3. 對照反應(yīng)中，加入 1ul 的非重組 DNA。
可以選擇：對于用來確定插入方向的反應(yīng)，向恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)管中加入第三個插入物特異的引物。
4. 對于重組篩選，用一個無菌槍頭刺挑一下轉(zhuǎn)化后長出的菌落，然后在相應(yīng)的反應(yīng)管中攪動菌落物質(zhì)。在給每一個反應(yīng)混合物接種后，迅速地移走槍頭，并在含有抗生素平板上輕涂以留菌種，以備后續(xù)分析。對于 PCR 介導(dǎo)的重組篩選，也可參考下面的疑難解答。
5. 輕輕混勻每個反應(yīng)體系。
6. 用推薦的循環(huán)參數(shù)進行 PCR。
7. 用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物。推薦用 10~15 g/L 瓊脂糖凝膠來優(yōu)化分辨500~6000bp 的 PCR 產(chǎn)物。通常，取 1~5ul PCR 產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色后分析。可以通過傳統(tǒng)的瞬間成像技術(shù)或計算機圖像軟件來獲取圖像。 |
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