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細胞培養中的污染分為兩類，化學污染和生物污染。
化學污染
化學污染是一些對細胞有毒性的或對細胞產生刺激的化學物質。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學試劑和質量較差的蒸餾水等。
化學污染中比較引人注意的是細菌內毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質，對塑料等疏水性強的物質有很強的吸附能力。細菌內毒素可刺激部分細胞產生一些激素或細胞因子，對細胞生長和實驗結果產生影響。細菌內毒素是臨床上的zui主要的熱原（即注射到動物體內會導致動物發熱），所以通過細胞培養生產的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產過程中更是要避免細菌內毒素的污染。
生物污染
生物污染包括比較容易發現的細菌、霉菌和酵母的污染，和較難發現的病毒、支原體和其他細胞的污染。
細菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養液產生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。
由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發現，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內，對整個細胞培養不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結果。
1956 年 Robinson 及其同事發現細胞培養中的支原體污染。90年代初美國的一個調查發現，在該國的細胞培養中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細胞壁，在細胞培養液中幾乎是透明的，同時對常用于細胞培養中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養液渾濁，所以支原體污染不容易被發現，但是其存在會影響實驗的結果。
細胞的交叉污染在細胞培養中發生的嚴重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細胞株的調查顯示：超過 60 標記為其他細胞株的細胞居然是 HeLa 細胞。
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