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流式細(xì)胞儀的使用一般分為三個(gè)步驟。，是儀器前階段，包括試劑的準(zhǔn)備，細(xì)胞制備、細(xì)胞的熒光染色；第二，是流式細(xì)胞儀階段，主要是儀器的操作；第三，是結(jié)果分析階段。

淋巴細(xì)胞外周血的白細(xì)胞

FACS緩沖液PBS疊氮鈉溶液儀器緩沖液FACS清潔液FACS洗凈液

流式細(xì)胞儀

一、 細(xì)胞和試劑的準(zhǔn)備

1.  細(xì)胞樣品：來(lái)源淋巴細(xì)胞或外周血的白細(xì)胞。

2.  熒光標(biāo)記單克隆抗體：常用的有FITC（fluorescein -isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）標(biāo)記的單克隆抗體。

3.  封閉抗體：抗Fc受體抗體

4.  FACS緩沖液：

1×PBS  950 ml

FCS  40 ml

10%疊氮鈉溶液  10 ml

5.  儀器緩沖液（FACS-flow）：儀器廠家提供

6.  FACS清潔液（FACS clean ）和FACS洗凈液（FACS rinse）：儀器廠家提供。

二、操作步驟
 

1.  單細(xì)胞懸液的制備：將1×10⁵~1×10⁷的細(xì)胞放入1.5 m l離心管中3000 r/min 離心5分鐘，棄上清；加入FACS緩沖液100 μl 懸浮細(xì)胞。

2.  封閉細(xì)胞表面Fc受體：在步驟1中加入Fc受體抗體0.5 μl（0.5 mg/ml），水浴3分鐘。

3.  細(xì)胞與熒光抗體結(jié)合：在步驟2中加入熒光抗體1 μl（0.5 mg/ml），水浴30分鐘。

4.  洗細(xì)胞去除游離的熒光抗體：在步驟3中加入FACS緩沖液350 μl，輕輕混勻，3000 r/min，離心5分鐘，棄上清，重復(fù)步驟（4）2次。

5.  上樣前處理：取100 μl 儀器緩沖液加入步驟（4）獲得的細(xì)胞沉淀中，輕輕混勻懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入FACS管中，準(zhǔn)備進(jìn)行儀器檢測(cè)和分析。

三、儀器的操作

以FACSCaliburTM（BD Biosciences）儀器為例。儀器主要分為主機(jī)部分（包括激光激活源，射流，射線探測(cè)器）和計(jì)算機(jī)部分（CELLQuest softwere）。儀器的操作分為使用前的準(zhǔn)備、使用中的操作和使用后的清洗。

1.使用前的準(zhǔn)備

（1）打開電源：包括系統(tǒng)電源和主機(jī)部分電源。

（2）檢查供液槽和廢液槽：供液槽應(yīng)含足夠的儀器緩沖液，廢液槽應(yīng)在上次使用后清洗干凈。

（3）使機(jī)器處于負(fù)亞狀態(tài)，才能使細(xì)胞懸液被吸入至機(jī)器的吸管口。

（4）機(jī)器處于可應(yīng)用狀態(tài)時(shí)，指示燈會(huì)變成綠色。

2.使用中的操作

（1） 計(jì)算機(jī)部分—使用CELLQuest程序系統(tǒng)軟件：

①設(shè)定所要檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量：一般設(shè)10 000~20 000個(gè)細(xì)胞。

②命名本次實(shí)驗(yàn)：一般含使用者的姓名和實(shí)驗(yàn)日期。

③打開記數(shù)部分：顯示進(jìn)入的細(xì)胞數(shù)以及檢測(cè)一定量的細(xì)胞所需要的時(shí)間。

④將微機(jī)與主機(jī)連接：控制檢測(cè)時(shí)的預(yù)檢測(cè)和實(shí)際檢測(cè)。

⑤主機(jī)設(shè)定：一般是已設(shè)定好的適合測(cè)定淋巴細(xì)胞的條件，包括探測(cè)器的電壓。探測(cè)器的電壓是調(diào)空光電倍增管所能檢測(cè)熒光密度的范圍。

⑥選擇檢測(cè)的波長(zhǎng)和表達(dá)方式（plot）：如果用一種熒光抗體，一般選直方圖（histogram）；如果用兩種熒光抗體，常選點(diǎn)狀二維圖（dot plot）或輪廓線圖（contour plot）表

 CD69分子表達(dá)檢測(cè)直方圖的數(shù)值說(shuō)明
 

b.abti-CD3（2 ng/ml）檢測(cè)結(jié)果
 

c.abti-CD3（10 ng/ml）檢測(cè)結(jié)果
 

CD4及CD8細(xì)胞點(diǎn)狀二維圖結(jié)果
 

不同的熒光物要求選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)，參見下表
 

（2）細(xì)胞的吸入：將裝有細(xì)胞的FACS測(cè)定管放置到機(jī)器吸管孔處。

先預(yù)檢測(cè)樣品，然后進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。可根據(jù)細(xì)胞的濃度選擇測(cè)定的速度（低、中或高）。所有的數(shù)據(jù)將自動(dòng)存入微機(jī)。

3.使用后的清洗  所有樣品測(cè)定完后，要進(jìn)行儀器的清洗。

（1）將裝FACS清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入1分鐘。

（2）將裝FACS洗凈液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入 1分鐘。

（3）再將裝FACS清潔液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（4）同樣再將裝FACS洗凈液的FACS管放置機(jī)器吸管孔，高速吸入5分鐘。

（5）后將一裝有雙蒸水的FACS管放置機(jī)器吸管孔后，關(guān)閉機(jī)器。

（6）將廢液槽中的廢液倒掉，并清洗干凈廢液槽。

1.  減少非特異熒光染色

（1）細(xì)胞的活性和狀態(tài)：流式細(xì)胞儀不但可探測(cè)細(xì)胞表面的熒光，也可探測(cè)細(xì)胞內(nèi)的熒光。因此，如果要檢測(cè)細(xì)胞表面的分子，一定要保證細(xì)胞的活性，還應(yīng)盡可能保持細(xì)胞靜止，通常在4度進(jìn)行操作。否則，熒光抗體進(jìn)入死細(xì)胞內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生非特異結(jié)果。

（2）封閉抗體的應(yīng)用是*的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的免疫細(xì)胞表面都表達(dá)有Fc-R。細(xì)胞與抗體相互作用后，一定要用FACS緩沖液洗2~3次，以除去游離的抗體。

2.  單染色時(shí)以FACS常用，F(xiàn)ITC標(biāo)記抗體熒光比較穩(wěn)定而且價(jià)格合適。

3.  如果同時(shí)要檢測(cè)兩種以上的分子，一定要選擇不同波長(zhǎng)的熒光所標(biāo)記的抗體。